[ Pobierz całość w formacie PDF ]
.IV.3.7).Obecność dÅ‚ugich Å‚aÅ„cuchów alkilowych (C30) zwiÄ™kszaoddziaÅ‚ywanie fazy stacjonarnej z aromatycznymi i alifatycznymi fragmentami czÄ…steczekrozdzielanych substancji, co skutkuje wydÅ‚użeniem czasów retencji.94 Dodatkowo dla powyższej kolumny zaobserwowano zmianÄ™ kolejnoÅ›ci elucji dladwóch par analitów: metabolitów paracetamolu oraz paracetamolu i sotalolu.Porównaniechromatogramów przedstawiono na rysunku IV.3.7.Rysunek IV.3.7.Chromatogram wzorców leków i metabolitów zarejestrowany na detektorze DAD dla kolumnykolumny C30 porównany z chromatogramem zarejestrowanym dla kolumny wzorcowej (Purospher Star).Substancje wzorcowe: 1- glukuronian paracetamolu; 2- siarczan paracetamolu; 3- paracetamol; 4- sotalol; 5-kwas gentyzynowy; 6- ±-hydroksymetoprolol; 7- o-demetylometoprolol; 8- siarczan 4 -hydroksypropranololu;9- metoprolol; 10- kwas salicylowy; 11- propranolol; 12- glukuronian ketoprofenu; 13- ketoprofen.Siarczan paracetamolu w opracowanych warunkach analizy (obecność zÅ‚oża C30) wykazujewiÄ™ksze powinowactwo do fazy ruchomej o odczynie kwaÅ›nym i ulega elucji w pierwszejkolejnoÅ›ci.Jest to spowodowane obecnoÅ›ciÄ… grupy sulfonowej (SO3H), dla której wartośćpKa wynosi -2,16 (wartość obliczona za pomocÄ… oprogramowania Chemaxon MarvinSketch).Dysocjacja grupy sulfonowej nie zostaje zablokowana przez dodatek kwasutrifluorooctowego (pKa= 0,23).W przypadku glukuronianu paracetamolu dodatek kwasu95trifluorooctowego uniemożliwia odszczepienie protonu z grupy karboksylowej (pKa= 3,17),obniżajÄ…c jednoczeÅ›nie jego powinowactwo do fazy ruchomej.Podobna sytuacja ma miejsce w przypadku paracetamolu i sotalolu.Paracetamol,niezdysocjowany, wykazuje wiÄ™ksze powinowactwo do zÅ‚oża C30.Natomiast sotalol (rysunekIV.3.8) ulegajÄ…cy protonowaniu, wykazuje wiÄ™ksze powinowactwo do fazy ruchomej.Skutkuje to zamianÄ… kolejnoÅ›ci elucji i wyeluowaniem sotalolu przed paracetamolem.Struktura, jakÄ… zachowujÄ… anality w fazie ruchomej, ma niewielki wpÅ‚yw na kolejność elucjiw przypadku zastosowania kolumn C8-C18.W przypadku zastosowania zÅ‚oża C30, bardziejhydrofobowego od pozostaÅ‚ych, jako pierwsze elucji ulegajÄ… substancje o wiÄ™kszej zawartoÅ›ciatomów o charakterze polarnym oraz posiadajÄ…ce strukturÄ™ jonowÄ….Rysunek IV.3.8.Graficzne przedstawienie sotalolu ulegajÄ…cego protonowaniu.Dla kolumny ze zÅ‚ożem C30, stosujÄ…c  gradient podstawowy (program elucjigradientowej nr II, tabela III.1), zaobserwowano częściowÄ… koelucjÄ™ sotalolu i paracetamoluoraz zbliżenie pików pochodzÄ…cych od kwasu salicylowego i propranololu.W celu poprawyzdolnoÅ›ci rozdzielczej, przeprowadzono modyfikacjÄ™ programu elucji gradientowej.Zmianydokonane w trakcie doboru skÅ‚adu fazy ruchomej przedstawiono w tabeli IV.3.5.Tabela IV.3.5.Program elucji gradientowej zmodyfikowany dla kolumny Develosil RP-AQUEOUS-AR-5.StrzaÅ‚ki obrazujÄ… kierunek zmian kompozycji fazy ruchomej.PrzepÅ‚yw fazyCzas (min) MeOH 0,05% TFA ACNruchomej (ml/min)0 2¯ð 93 5­ð 1,017 30 48¯ð 22­ð 1,020 30 30 40 1,025 5 50¯ð 45­ð 1,2Po zastosowaniu opracowanego ukÅ‚adu gradientowego uzyskano rozdzielenie wszystkichanalitów.Porównanie chromatogramów zarejestrowanych przy zastosowaniu96 podstawowego programu elucji gradientowej nr II (tabela III.1) i zmodyfikowanegoprogramu elucji gradientowej (tabela IV.3.5) na kolumnie ze zÅ‚ożem C30 przedstawiono narysunku IV.3.9.Rysunek IV.3.9.Chromatogram wzorców leków i metabolitów zarejestrowany dla kolumny C30 (modyfikacjagradientu) porównany z chromatogramem zarejestrowanym dla kolumny C30 z zastosowaniem gradientu podstawowego.Chromatogramy rejestrowano stosujÄ…c detektor DAD.Substancje wzorcowe: 1- glukuronianparacetamolu; 2- siarczan paracetamolu; 3- paracetamol; 4- sotalol; 5- kwas gentyzynowy; 6-±-hydroksymetoprolol; 7- o-demetylometoprolol; 8- siarczan 4 -hydroksypropranololu; 9- metoprolol; 10- kwassalicylowy; 11- propranolol; 12- glukuronian ketoprofenu; 13- ketoprofen.IV.3.3.Wybór optymalnej kolumny do dalszych badaÅ„.WykorzystujÄ…c optymalne ukÅ‚ady chromatograficzne opracowane dla każdej z kolumnchromatograficznych, wyznaczono nastÄ™pujÄ…ce wielkoÅ›ci: współczynniki retencji (k),rozdzielczość pików (RS), liczbÄ™ półek teoretycznych (N) oraz asymetriÄ™ pików (Asym.).Dotestowania kolumn chromatograficznych stosowano mieszaninÄ™ wzorców o stężeniu 3µg/mlkażdego z leków i metabolitów.W tabeli IV.3.6 zestawiono parametry wyznaczone z użyciemkolumn chromatograficznych poddanych badaniu.Na podstawie obliczonych parametrówdokonano wyboru optymalnej kolumny do oznaczeÅ„ wyżej wymienionych substancji.97Tabela.IV.3.6.Współczynniki retencji, rozdzielczość pików, liczba półek teoretycznych oraz asymetria pików dla badanych substancji naprzebadanych kolumnach chromatograficznych [ Pobierz caÅ‚ość w formacie PDF ]