[ Pobierz całość w formacie PDF ]
.IV.3.7).Obecność długich łańcuchów alkilowych (C30) zwiększaoddziaływanie fazy stacjonarnej z aromatycznymi i alifatycznymi fragmentami cząsteczekrozdzielanych substancji, co skutkuje wydłużeniem czasów retencji.94 Dodatkowo dla powyższej kolumny zaobserwowano zmianę kolejności elucji dladwóch par analitów: metabolitów paracetamolu oraz paracetamolu i sotalolu.Porównaniechromatogramów przedstawiono na rysunku IV.3.7.Rysunek IV.3.7.Chromatogram wzorców leków i metabolitów zarejestrowany na detektorze DAD dla kolumnykolumny C30 porównany z chromatogramem zarejestrowanym dla kolumny wzorcowej (Purospher Star).Substancje wzorcowe: 1- glukuronian paracetamolu; 2- siarczan paracetamolu; 3- paracetamol; 4- sotalol; 5-kwas gentyzynowy; 6- �-hydroksymetoprolol; 7- o-demetylometoprolol; 8- siarczan 4 -hydroksypropranololu;9- metoprolol; 10- kwas salicylowy; 11- propranolol; 12- glukuronian ketoprofenu; 13- ketoprofen.Siarczan paracetamolu w opracowanych warunkach analizy (obecność złoża C30) wykazujewiększe powinowactwo do fazy ruchomej o odczynie kwaśnym i ulega elucji w pierwszejkolejności.Jest to spowodowane obecnością grupy sulfonowej (SO3H), dla której wartośćpKa wynosi -2,16 (wartość obliczona za pomocą oprogramowania Chemaxon MarvinSketch).Dysocjacja grupy sulfonowej nie zostaje zablokowana przez dodatek kwasutrifluorooctowego (pKa= 0,23).W przypadku glukuronianu paracetamolu dodatek kwasu95trifluorooctowego uniemożliwia odszczepienie protonu z grupy karboksylowej (pKa= 3,17),obniżając jednocześnie jego powinowactwo do fazy ruchomej.Podobna sytuacja ma miejsce w przypadku paracetamolu i sotalolu.Paracetamol,niezdysocjowany, wykazuje większe powinowactwo do złoża C30.Natomiast sotalol (rysunekIV.3.8) ulegający protonowaniu, wykazuje większe powinowactwo do fazy ruchomej.Skutkuje to zamianą kolejności elucji i wyeluowaniem sotalolu przed paracetamolem.Struktura, jaką zachowują anality w fazie ruchomej, ma niewielki wpływ na kolejność elucjiw przypadku zastosowania kolumn C8-C18.W przypadku zastosowania złoża C30, bardziejhydrofobowego od pozostałych, jako pierwsze elucji ulegają substancje o większej zawartościatomów o charakterze polarnym oraz posiadające strukturę jonową.Rysunek IV.3.8.Graficzne przedstawienie sotalolu ulegającego protonowaniu.Dla kolumny ze złożem C30, stosując  gradient podstawowy (program elucjigradientowej nr II, tabela III.1), zaobserwowano częściową koelucję sotalolu i paracetamoluoraz zbliżenie pików pochodzących od kwasu salicylowego i propranololu.W celu poprawyzdolności rozdzielczej, przeprowadzono modyfikację programu elucji gradientowej.Zmianydokonane w trakcie doboru składu fazy ruchomej przedstawiono w tabeli IV.3.5.Tabela IV.3.5.Program elucji gradientowej zmodyfikowany dla kolumny Develosil RP-AQUEOUS-AR-5.Strzałki obrazują kierunek zmian kompozycji fazy ruchomej.Przepływ fazyCzas (min) MeOH 0,05% TFA ACNruchomej (ml/min)0 2�� 93 5�� 1,017 30 48�� 22�� 1,020 30 30 40 1,025 5 50�� 45�� 1,2Po zastosowaniu opracowanego układu gradientowego uzyskano rozdzielenie wszystkichanalitów.Porównanie chromatogramów zarejestrowanych przy zastosowaniu96 podstawowego programu elucji gradientowej nr II (tabela III.1) i zmodyfikowanegoprogramu elucji gradientowej (tabela IV.3.5) na kolumnie ze złożem C30 przedstawiono narysunku IV.3.9.Rysunek IV.3.9.Chromatogram wzorców leków i metabolitów zarejestrowany dla kolumny C30 (modyfikacjagradientu) porównany z chromatogramem zarejestrowanym dla kolumny C30 z zastosowaniem gradientu podstawowego.Chromatogramy rejestrowano stosując detektor DAD.Substancje wzorcowe: 1- glukuronianparacetamolu; 2- siarczan paracetamolu; 3- paracetamol; 4- sotalol; 5- kwas gentyzynowy; 6-�-hydroksymetoprolol; 7- o-demetylometoprolol; 8- siarczan 4 -hydroksypropranololu; 9- metoprolol; 10- kwassalicylowy; 11- propranolol; 12- glukuronian ketoprofenu; 13- ketoprofen.IV.3.3.Wybór optymalnej kolumny do dalszych badań.Wykorzystując optymalne układy chromatograficzne opracowane dla każdej z kolumnchromatograficznych, wyznaczono następujące wielkości: współczynniki retencji (k),rozdzielczość pików (RS), liczbę półek teoretycznych (N) oraz asymetrię pików (Asym.).Dotestowania kolumn chromatograficznych stosowano mieszaninę wzorców o stężeniu 3�g/mlkażdego z leków i metabolitów.W tabeli IV.3.6 zestawiono parametry wyznaczone z użyciemkolumn chromatograficznych poddanych badaniu.Na podstawie obliczonych parametrówdokonano wyboru optymalnej kolumny do oznaczeń wyżej wymienionych substancji.97Tabela.IV.3.6.Współczynniki retencji, rozdzielczość pików, liczba półek teoretycznych oraz asymetria pików dla badanych substancji naprzebadanych kolumnach chromatograficznych [ Pobierz całość w formacie PDF ]